绝大多数有限细胞系及连续细胞系在体外进行原代培养时都是贴壁生长的，培养的细胞一经接触培养基质就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养。

为获得大量的、稳定的同种细胞，并保证细胞始终维持快速生长，可以将单层细胞从培养基质上分离下来制成单细胞悬液，按照推荐浓度接种到若干个新的培养器皿内继续培养，这个过程就称为传代（Passage）或再培养（Subculture）。 对单层培养而言，细胞生长接近指数生长期末时（大约70%-90%汇合），即可进行传代。一般生长稳定的细胞4~7天传代一次。

一、单层培养传代步骤：

1. 事先将培养基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室温平衡，并准备若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培养器皿。注：不推荐使用37℃水浴锅对上述溶液进行平衡。

2. 将长满细胞的培养器皿中原有培养液吸弃，DPBS洗涤细胞1-2次。

3. 加入适量（略盖过细胞即可）Trypsin-EDTA溶液室温孵育0.5-2 min，不定时在显微镜下观察细胞状态，直至约80%细胞收缩、变圆突起（round up），立即加入等体积Trypsin中和液终止消化。 注：不同类型细胞消化时间长短不一，最佳消化时间需自行摸索。

5. 将收获的细胞悬液于1000rpm下离心5min，弃上清，然后用适量完全培养基重悬细胞。

6. 计数细胞，然后根据推荐的接种密度重新接种到新的已包被好的培养皿内。将培养器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培养箱培养，视细胞生长情况，每隔2-3天换一次液，详见datasheet。 注：有限细胞系的增殖速率较低，其原代培养通常以1:1，1:2或1:3的比例进行传代，但是对于增殖速率很高的连续细胞系（或无限细胞系），通常要以更高的比例进行传代。

二、单层培养细胞经常遇到的问题及解决方案：

1. 细胞难脱离

• 培养基内含有某些抑制成分（例如血清）使细胞解离液失活。

解决对策：在加入细胞解离液（dissociating solution）之前，先用DPBS润洗细胞两次或者是直接用细胞解离液润洗细胞。

• 选用的细胞解离液太弱。

解决对策：提高酶浓度、EDTA浓度，或者使用作用更强的细胞解离液（如dispase, collagenase），或者是把细胞置于37°C孵育以提高解离液的活性。

• 细胞达到100%汇合时间太久，细胞间连接变得非常牢固，阻碍了解离液渗透到细胞与培养基质接触的界面。

解决对策：当细胞达到大约70%-90%汇合时，即进行传代。

2. 细胞脱离下来后聚集成团（Clumps）

• 分离过程太剧烈，导致细胞裂解释放基因组DNA。

原因有二：第一，移液枪吹打太剧烈；第二，选用的细胞解离液太强或有毒性，导致pH或渗透压异常。

解决对策：往细胞悬液内加入一滴无菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA链断裂。在随后的操作中，注意温和吹打细胞悬液，缩短孵育时间，换用弱一点的细胞解离液或者在低一点的温度下孵育。

• 如果收集的单细胞悬液没有立即加入培养基稀释并接种到新的培养皿内继续培养，而是在室温放置一段时间。这种情况下，细胞也有可能会聚集成团。

解决对策：将细胞悬液放置在冰上。

• 细胞悬液离心去除多余解离液时，离心太剧烈或时间过久。

解决对策：确保温和离心，推荐使用125g离心10 min。

3. 细胞重新贴壁困难

• 细胞解离过程持续时间过长，使得存在于细胞膜上的细胞附着所必需的蛋白剥离。

• 培养基内缺少足够的血清或黏附因子（常见于无血清培养基）。

解决对策：往培养基内添加黏附因子或者选用蛋白（collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.）包被过的培养容器。

• 未失活细胞解离液或者离心去除细胞解离液。

解决对策：在培养基内添加额外的血清或特异性酶抑制剂（例如，大豆胰蛋白酶抑制剂）中和细胞解离液。亦或使用125g离心5min去除细胞解离液，然后使用新鲜培养基重悬细胞。

4. 细胞活力低

• 细胞分离过程太剧烈

解决对策：自行摸索最佳解离时间。

• 配制细胞分离液所用的平衡盐溶液（Balanced Salt Solution）pH或渗透压异常。

解决对策：测量pH或渗透压或直接换一瓶新的平衡盐溶液。

• 在重新接种之前，单细胞悬液以非常高的细胞密度在室温放置时间过长。

解决对策：将细胞悬液置于冰上。

• 培养基选择不恰当。

解决对策：推荐使用与原代细胞相配套的专属培养基。