一、间接 ELISA

1、缓冲液和试剂

通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，可精确定量。每块板都要带标准（做平行或者三份）和空白对照以保证精确性。

常规程序

包被抗原

- 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上的第一排孔，按要求往后进行系列稀释。

- 样品纯度较高时通常在酶标板上稀释到不低于 2μg/ml。

- 不一定用纯化的溶液，不过，一般在试验样品中目的蛋白（抗原）含量需大于 3%。

- 抗原的蛋白浓度在酶标板上应该不高于 20μg/ml，此时已经足够中和酶标板上的位点了。

- 确保抗原的浓度在抗体可以检测到的范围内。

- 在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。包被的孵育时间需要优化。

- 倒掉孵育溶液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 3 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

封闭

- 用 200μl 含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。或者用其他封闭剂如 BlockACE、BSA（牛血清 蛋白）代替。

- 用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。

- 用 PBS 洗板 2 次。

- 加一抗和二抗进行孵育

- 每孔加入 100μl 稀释好的一抗。

- 用封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，该孵育时间需要进行优化。尽管 2 小时的孵育通常可以获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱时 ，通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。

- 用 PBS 洗板 4 次。

- 加 100μl 标记二抗，稀释到最佳浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。

- 用封口膜覆盖酶标板室温孵育 1-2 小时。

- 用 PBS 洗板 4 次。

检测

虽然许多种类的酶都可以用来检测，但辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 实验中是被广泛应用的两种酶。我们必须要考 虑到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性（例如肺泡细胞中高含量的 AP，红血球中高含量的过氧化物酶），这可能导致不精确的结果。 如果有必要的话，用左旋咪唑（针对 AP）或含 0.3% 双氧水溶液的甲醇（针对过氧化物酶）进行一个附加的封闭处理。

AP 底物

pNPP（对硝基苯基磷酸盐）是最广泛使用的底物。室温下孵育 15-30 分钟后，硝基酚的黄颜色可以在 405nm 下被检测出（这一反应可以通 过加入适当量的 0.75M 氢氧化钠溶液来终止）。

HRP   显色剂

HRP    的底物是过氧化氢，反应中，过氧化氢分裂使氢供体氧化产生颜色变化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯

加 TMB 溶液至每孔，孵育 15-30 分钟，加相同分量终止液（2M 硫酸），在 450nm 下读取吸光度值。

OPD (邻苯二胺盐酸盐)

终产物在 492nm 下检测。需要注意的是这种底物对光敏感，因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氢二铵盐)

终产物是绿色的，在 416nm 测定吸光度值。

注意：一些酶底物是有害的（致癌物），因此必须小心操作并佩戴手套。

- 用多通道吸液器向每孔加入 100μl（或 50μl）底物。

- 显示出足够深的颜色之后，再向每孔加终止液 100μl（如果必须）。

- 用酶标仪读每个孔的吸光度值（光密度）。

数据分析

根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x轴为浓度（对数转换），y轴为吸光度值（线性）。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。

二、直接ELISA操作步骤

1、常规程序

包被抗原

- 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后进行系列稀释。

- 样品纯度较高时通常在酶标板上稀释到不少于 2μg/ml。

- 不一定用纯化的溶液，不过，一般在试验样品中目的蛋白（抗原）含量需大于 3%。

- 抗原的蛋白浓度在酶标板上应该不高于 20μg/ml，此时已经足够中和酶标板上的位点了。

- 确保抗原的浓度在抗体可以检测到的范围内。

- 在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。包被的孵育时间需要优化。

- 倒掉孵育溶液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。封闭

- 用 200μl 含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的PBS缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。或者用其他封闭剂如 BlockACE、BSA（牛血清蛋 白）代替。

- 用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。

- 用 PBS 洗板 2 次。

加抗体孵育

-加入 100 μl 抗体，稀释到最佳浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。

- 用封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，该孵育时间需要进行优化。尽管 2 小时的孵育通常可以获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱 时，通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。

- 用 PBS 洗板 4 次。

检测

- 用多通道吸液器向每孔加入 100μl（或 50μl）底物。

- 显示出足够深的颜色之后，再向每孔加终止液 100μl（如果必须）。

- 用酶标仪读每个孔的吸光度值（光密度）。

注意：一些酶作用物是有害的(致癌物)，因此必须小心操作并佩戴手套。

数据分析

- 根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x 轴为浓度（对数转换），y 轴为吸光度值（线性）。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。

三、夹心 ELISA

夹心 ELISA 用两种抗体协同测定抗原的含量（例如：捕获抗体和检测抗体）。抗原必须包含至少 2 个能被抗体识别的抗原位点才能被检测 ，因为至少有 2 个抗体参与到这个试验中。

夹心 ELISA 中，单克隆抗体和多克隆抗体都可以被用作捕获和检测抗体。单抗识别单一的抗原表位，可以区别抗原的微小差别使抗原得到 更精确地检测和定量。多克隆抗体通常被用作捕获抗体,以捕获尽可能多的抗原。

夹心 ELISA 的优势是样品在分析前不需要纯化, 检测灵敏度高（灵敏度是直接法或间接法的 2-5 倍）。

注意事项：

夹心 ELISA 的步骤很难优化，试验中应使用测试过的配对抗体。这样可以确保在不干扰其他抗体结合的情况下，检测目标蛋白上相应的不同 抗原表位。因此对于没有做过特定测试试验的抗体，我们不能确保我们的抗体可以用于夹心 ELISA。请参阅抗体说明书有关抗体测定应用的信息。

1、常规步骤：

包被捕获抗体

- 用碳酸盐/重碳酸盐缓冲液 (pH7.4) 稀释捕获抗体至浓度 1-10μg/ml，包被酶标板。

  如果使用了没有纯化的抗体（例如:腹水或抗血清），可能需要通过提高样品蛋白浓度（试一下 10μg/ml），来补偿特定抗体数量较低的问题。

-  用封口膜覆盖酶标板,于 4°C 孵育过夜

- 倒掉包被液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

封闭和加样品

- 封闭包被后孔内残留的蛋白结合位点,每孔加 200μl，含 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭液。

- 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育至少 1-2 小时或者如果方便的话，4°C 孵育过夜。

- 每孔加 100μl 适当稀释的样品。在精确定量测定时，通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，每块板都要带标准（做平行或者三 份）和空白对照以保证精确性。37°C 孵育 90 分钟。

- 对于定量检测，标准品的使用浓度应覆盖抗体结合的大部分动态检测范围。您可能需要优化标准品的浓度使用范围，以确保得到一个合适的标准曲线。为了精确定量，样品和标准通常做 2 份或 3 份。

- 倒掉样品,每孔用 200μl PBS 洗板 2 次。

- 用检测抗体和二抗先后进行孵育

- 每孔加入 100μl 稀释好的检测抗体。

  确保检测抗体与包被抗体识别目标蛋白上不同的抗原表位，这防止了抗体结合的冲突，保证第二个抗体结合位点可以用来结合，尽可能的使用测试过相匹配的配对抗体。

- 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育 2 小时。

- 用 PBS 洗板 4 次

- 加入 100μl 标记二抗，使用前用封闭液快速稀释至最佳浓度（根据说明书）。 

- 用封口膜覆盖酶标板,室温孵育 1-2 小时。 

- 用 PBS 洗板 4 次。

检测

虽然许多种类的酶都可以用来检测，但辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 实验中是被广泛应用的两种酶。我们必须要考虑 到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性（例如肺泡细胞中高含量的AP,红血球中高含量的过氧化物酶），这可能导致不精确的结果。如 果有必要的话，用左旋咪唑（针对 AP）或含 0.3% 双氧水溶液的甲醇（针对过氧化物酶）进行一个附加的封闭处理。

AP 底物

pNPP（对硝基苯基磷酸盐）是最广泛使用的底物。室温下孵育 15-30 分钟后，硝基酚的黄颜色可以在 405nm 下被检测出（这一反应可以通 过加入适当量的 0.75M 氢氧化钠溶液来终止）。

HRP    显色剂

HRP 的底物是过氧化氢，反应中，过氧化氢分解使氢供体氧化产生颜色变化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯)

加 TMB 溶液至每孔，孵育 15-30 分钟，加适量终止液（2M 硫酸），在 450nm 下读取吸光度值。

OPD (邻苯二胺盐酸盐)

终产物在492nm下检测。需要注意的是这种底物对光敏感，因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氢二铵盐)

终产物是绿色的，在 416nm 测定吸光度值。

注意：一些酶作用物是有害的(致癌物)，因此必须小心操作并佩戴手套。

         使用多通道移液器每孔加入底物溶液 100μl（或 50μl）。

数据分析 

- 根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x 轴为浓度(对数转换)，y轴为吸光度值(线性)。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。

四、ELISA 疑难解答提示

1、阴性对照出现阳性结果

- 试剂/样品污染

   试剂和样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂，小心操作移液器。

- 夹心ELISA  - 检测抗体与包被抗体反应

   确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,他们之间不会互相反应。

- 酶标板洗板不彻底

  用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净。

- 抗体量过多导致非特异结合

根据推荐用量使用抗体。尽量使用较少的抗体。

2、酶标板整体背景高

- 结合反应太强或时间过长

  检查底物的稀释，使用建议的稀释度。当酶标板显色足够进行吸光度读取时立即用终止液终止反应。

- 底物溶液或终止液不是新配制

  使用新配制的底物溶液。终止液应该是清亮的（如果它变黄，这是被污染的标志，需要重新配制）。

- 没有终止反应

  如果底物反应没有被终止，颜色会继续变化。

- 酶标板在酶标仪读板前放置时间过长

颜色会继续变化（尽管加了终止液，依然会以很慢的速度变化)。

- 试验器皿污染 

  确保试剂是新配的并且使用的是清洁的玻璃器具

- 底物孵育过程没有避光

  底物孵育应该在避光条件下进行。

- 孵育温度过高

  抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性。确保孵育在正确的温度下进行，孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。

- 抗体非特异性结合

  确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。我们建议使用 5-10% 的与二抗同种动物来源的血清或牛血清。

  确保板孔经过预处理以防止非特异结合。使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收。

3、吸光度数值低

- 使用的样品中没有显示出靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低

  检查靶蛋白表达系统，确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低，需要增加样品使用量，或者您可能需要选择一个更灵敏 的测定方法。确保您使用的是没有超出测定方法检测范围的阳性对照。

- 抗体不足

  确定使用的是建议的抗体量，为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度。

- 底物溶液不是新鲜配制或成分有误

  使用前新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且被正确储存，使用的浓度也是正确的。确保试剂按正确的浓度使用。

- 试剂不是新鲜配制或pH值有误

  确保试剂配制正确并在有效期内。

- 孵育时间不够长

  如果建议了孵育时间，确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想，孵育时间可能需要增加。

- 孵育温度太低

  抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性，确保孵育是在正确的温度下进行，孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。确保所有的试剂在使用前是室温。

- 未加终止液

  加入终止液可以增加显色反应的强度，也能固定反应最终的颜色。

4、吸光度数值高

- 样品和/或阳性对照吸光度数值高。吸光度没有按样品在板子上的稀释度递减。

   样品或阳性对照的浓度过高，超出了试验方法检测的范围。重新设置试验方法或者在加样前通过稀释降低样品和对照的浓度，在处理结果计 算浓度时考虑到所作的稀释。

5、酶标板上吸光度不规律

- 孵育时酶标板叠在一起

  酶标板叠在一起使板子每个孔的温度不能平衡一致，请避免堆叠。

- 吸液不一致

  确保移液器使用正确并经过校准、确保枪头插得足够紧密。板子稀释时要特别仔细，注意确保每个枪头都吸上和排出正确量的液体，这对平 行样品结果的一致性有很大影响。

- 抗体稀释液/试剂未混匀

  为保证板子所有孔的浓度一致，确保所有的试剂和样品在加到板子上以前都被混合均匀。

- 板孔变干涸

   确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘(保持清洁，无菌水)在孵育箱的底部。

- 洗板不充分

   这将导致一些孔没有其他孔清洗的好，残留不同量的未结合的抗体，使后面的结果产生不一致。

- 酶标板底部不净影响吸光度读取

  读板前小心清洁酶标板底部。

5、颜色变化过慢

- 酶标板未处于恰当的温度中

  确保酶标板处于室温，试剂在使用前也处于室温。

- 结合能力太弱

  使用前新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且被正确储存，使用的浓度也是正确的。确保试剂按正确的浓度使用。

- 溶液污染 

  例如象叠氮化钠和过氧化物酶这类污染物的存在，将会影响底物的反应，避免使用含有这些防腐剂的试剂。

 声明：以上内容由Abcam公司提供。