ELISpot 常见问题汇总

ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名为酶联免疫斑点检测，结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。简单来说，就是用包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。

常见问题解答：

1. ELISpot板你们推荐使用哪种？

答：我们推荐使用带有PVDF膜并经乙醇预处理的ELISpot板，它能有效结合足够量的捕获抗体。

2. 为什么ELISpot板包被前要经乙醇预处理？

因为ELISpot板膜是疏水性的，乙醇处理后使之变为亲水性。亲水性ELISpot板膜才可以结合足够量的捕获抗体，捕获抗体量是否充足是得到高质量斑点的前提条件。

3. ELISpot板颜色很重要吗？我应该选择白色还是透明的？

白色和透明ELISpot板使用的都是PVDF膜，两种颜色只是外管上有些不同，对实验结果没有影响。

4. 怎样用乙醇预处理ELISpot板？

一般用乙醇短暂处理激活ELISpot板，预处理ELISpot板是非常关键的一步。不同的PVDF膜ELISpot板需要不同的预处理方法。

5. 为什么ELISpot推荐的包被抗体浓度比ELISA高很多？

ELISpot板带有PVDF膜，PVDF膜多孔结构可结合大量捕获抗体，可避免当分泌蛋白出现局部高浓度时不至于检测不到。捕获抗体较少时容易出现弱的、分散的大片斑点，不利于结果评价。不同体系包被抗体量也会不同，但是一般包被抗体量为每孔1-1.5µg。ELISA板包被抗体大约是这个量的十分之一。

6. 什么类型的细胞适合ELISpot分析？

ELISpot 和FluoroSpot 可使用任何类型的细胞。

7. 冷冻的细胞可以做ELISpot分析吗？

冷冻储存的细胞可以做ELISpot分析，但是结果取决于细胞质量。

8. ELISpot分析时每孔应加多少细胞?

每孔细胞数量需要根据细胞类型和预期的细胞分泌频率而定。当检测抗原特异性T细胞时，外周单个核细胞数量应该不低于200000个/每孔。一般细胞不要高于500000个/每孔，会产生多层细胞，降低斑点质量。

9. 我可以使用人血清做ELISpot分析吗？

我们不推荐使用人血清做ELISpot分析。

因为：1.当检测细胞因子时（例如IFN-γ）,血清中可能含有这个因子，它会和捕获抗体和检测抗体结合。2. 人血清中可能含有嗜异性抗体，它可以和任何物种的免疫球蛋白结合。

10. ALP和HRP结合物有什么不同？

ALP(碱性磷酸酶)和HRP(辣根过氧化物酶)是免疫分析中常用的酶。它们催化不同的反应，需要不同的底物。ELISpot中两种酶的灵敏性是一样的，但是辣根过氧化物酶反应更快速。

11. ELISpot中我应该使用哪种底物？

ELISpot需要沉淀型底物，ELISA底物不能用于ELISpot中，它不会产生斑点。我们推荐碱性磷酸酶使用BCIP/NBT-plus底物，辣根过氧化物酶使用TMB底物。

12. 为什么测试一天后TMB斑点变黄或几乎消失了？

当使用自来水洗板时，正常的蓝色斑点可能会变成几乎不可见的黄色，这是由水中离子化合物造成的。我们推荐实验时使用去离子水或蒸馏水。ALP酶和BCIP/NBT-plus底物不会出现类似的问题。

13. 为什么我在不加细胞的对照孔会看到非特异性斑点？

非特异性斑点很少发生。一个原因是生物素化的抗体经储存后产生沉淀。另一个原因是污染或缓冲液中有灰尘。

14. 你们有预期的ELISpot结果图片供参考吗？

通过以下网址可以看到预期结果图片。

15. 我可以使用ELISpot板做FluoroSpot吗？

为了避免自发荧光，Millipore可提供低荧光PVDF膜板供使用。

16. 实验完成后，最好多久读FluoroSpot板？

FluoroSpot板在干燥和黑暗中荧光是非常稳定的，可保存几个月。但是我们推荐最好在实验完成后一周内读板。