Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA，是生物医学研究者经常采用的研究方法，在实践的过程中会遇到各种问题，该如何解决？

1、阴性对照出现阳性结果

1.1 试剂/样品污染

试剂或样品可能污染，或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂，小心操作移液器

1.2 夹心ELISA-检测抗体与包被抗体反应

确定使用的是包被抗体检测抗体，二者之间不会相互反应

1.3 洗板不彻底

用洗液充满板孔，确保板孔充分洗涤

1.4 抗体过多导致非特异结合

根据推荐用量使用抗体

2、酶标板整体背景高

2.1 结合反应太强或时间过长

检查底物的稀释，使用建议的稀释度，当酶标板显色足够时进行吸光度读取时立即终止反应

2.2 底物溶液或终止液不是新配置

使用新鲜底物溶液，终止液应该为清亮颜色

2.3 无终止反应

若底物反应未被终止，颜色将会继续变化

2.4 酶标板在读数之前放置时间过长

颜色会继续缓慢的变化，即使加入终止液

2.5 实验器皿污染

使用干净的器皿

2.6 底物孵育过程未避光

底物孵育中需避光

2.7 孵育温度过高

优化孵育温度

2.8 抗体非特异结合

确保使用恰当的封闭液进行封闭，确保孔板经过预处理以防非特异结合

3、吸光度数值低

3.1 使用的样品未显示靶蛋白或者靶蛋白显示水平低

检查靶蛋白表达系统，或增加样品使用量，或选择更灵敏的测定方法，确保使用没有超出检测范围的阳性对照

3.2 抗体不足

确定使用推荐的抗体量

3.3 底物溶液不是新鲜配置或成分有误

使用新鲜配置的底物，确保试剂按照正确浓度使用

3.4 试剂不是新鲜配置或 pH 值有误

确保试剂正确配置并在有效期内

3.5 孵育时间不够长

增加孵育时间

3.6 孵育温度过低

优化孵育温度

3.7 未加终止液

加入终止液可以增加显色反应强度，也可固定反应最终的颜色

4、吸光度数值高

4.1 样品/阳性对照吸光度高，吸光度未按照板子的稀释度递减

样品/阳性对照浓度过高，超出实验检测范围，重新设置实验方法或在加样前通过稀释降低样品和对照的浓度。

5、酶标板吸光度不规律

5.1 孵育时酶标板叠在一起

酶标板叠在一起使每个孔板的温度不一致

5.2 吸液不一致

确保移液器正确使用

5.3 抗体稀释液/试剂未混匀

保证孔板的浓度一致，确保试剂和样品加到孔板里浓度一致

5.4 孔板变干涸

保持孔板周围湿润

5.5 洗板不充分

洗板不充分导致残留试剂影响后续结果

5.6 酶标板底部不干净影响吸光度读取

读板前小心清洁酶标板底部

6、孔板颜色变化过慢

6.1 酶标板未处于适当的温度中

确保酶标板及试剂处于室温状态

6.2 结合能力太弱

确保新鲜配置各种试剂

6.3 溶液污染

避免使用含有防腐剂的试剂。