PCR 电泳常见问题

PCR 常见问题解析

来源右哉实验万事屋

PCR出现了问题，没有条带，电泳后，产生了大量弥散带……

究竟是PCR的退火温度不对，还是反应体系的设计出了问题？究竟是模板的问题，亦或是引物设计出了纰漏？

实际上，嗯，是吃了文化的亏。要是英语学好了，就不会有这种困惑了……

好吧，其实一般我们都会在实验室里遇到这样或者那样的问题，那到哪里去问呢？要是师兄师姐不给力的话，只能去查了。

文化程度比较高的，英文水平比较好的童鞋们，就可以上下面这个网站去查：

这其实就是Research Gate……一个做实验的人必备的网站，包括下载文献之类的功能都有，包括大量的实验问题，都能在这里解决。只是，全英文而已……

于是我搜了一下“Smear PCR”，然后就发现：

有一百多个人都提过差不多的问题，随便挑两个哈：

还有这样的：

当然，我们总结一下，到底为什么PCR会产生这样的非特异性的弥散带哈：

1）模板量过多，在电泳时会形成弥散状；（一般不会有这么大量吧）

2）模板量过多，使得引物无法精准地结合到目的片段上，导致非特异性扩增增加；（不要一味地觉得模板越多扩增越好）

3）退火温度低，导致了非特异性扩增；（你们自己设计引物，自己知道哦）

4）循环次数过长，导致dNTP耗尽，产物聚合；（这个应该不常见，都用2×Mix了）

5）延伸时间太短，导致目的片段无法延伸出来，产物就自然产生弥散了；（就是人家要长20秒，你不能10秒就拔苗助长）

6）用热启动的话会降低弥散可能性；（就是买贵点的Mix）

7）模板断裂，可能会导致这样的情况；（特别是RNA的抽提，以及cDNA合成的过程中需要注意）

8）你用的2×Mix不太行；（这倒是有可能哈）

9）PCR仪坏了；（这得有多高难度把PCR都弄坏了呢）

10）电泳的凝胶没做好。（这一般会导致Marker也弥散）。