Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK-8/WST-8较传统MTT的特点：

1、WST-8是一种类似于MTT的化合物

在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

2、WST-8是MTT的一种升级替代产品

和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。

3、WST-8比XTT和MTS更稳定， 使实验结果更加稳定。

4、WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。

5、其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

CCK8试剂盒常见问题解答： 

1： 每孔应该接种多少细胞？

在使用标准96孔板时，贴壁细胞每孔至少需要接种1,000个细胞 (100ul的培养基)，检测白细胞时由于它的灵敏度较低，每孔至少需要接种2,500个细胞 (100 ul的培养基)，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。如果要使用24孔板或是6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK- 8溶液。

2：能否用384孔板进行试验？

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后就培养基体积20%的量。

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。

 4. 在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

有时会有影响。如果药物具有还原性，就会和CCK- 8试剂发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK- 8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (只加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK- 8之前更换培养基，去掉药物的影响。

 5. CCK- 8对细胞的毒性大小如何？

CCK- 8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。

6. CCK- 8的保质期有多久？

CCK- 8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存，我们推荐在-20℃储藏。在常温下可以保存3周左右，颜色应该为浅红色，如果颜色发生改变，则可能会增加空白吸光度。

您可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。

8. CCK- 8能否对活细胞进行染色?

不能。因为CCK- 8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体1- Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST?- 8上，因为WST- 8及其生成的甲臜染料是高度水溶性的，不会进入细胞内，所以CCK- 8不能对活细胞进行染色。

不一定要设定，CCK- 8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。

10. 如果O.D值太低，可以采取什么办法？

可以采取2个办法：

① 适当增加细胞数量。

② 延长加入CCK- 8试剂后的染色时间

11. 如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK- 8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验 (细胞毒性实验) 时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK 8，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

12. 哪些物质会影响CCK- 8的测定？

当有还原性物质存在时会影响CCK- 8的测定，增加O.D值；在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，减小O.D值；在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

13. CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？

有。然后，请注意由于CCK-9使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。

14. CCK-8能否检测细菌细胞？

可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100ul E.coli培养液中加入10ul CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。

可以再加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决方法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基（加CCK-8）的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8前更换培养基，去掉药物的影响。

可能会有以下几个原因：1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2. 有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000-1000000个/孔范围内摸索条件。

可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.

有以下几种方法（96孔板）：1、在显色反应后，将培养板放入4℃冰箱内。2、每孔加10ul 0.1M HCL溶液。3、每孔加10ul 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时内测定。

不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10Mm的话，将会100%抑制。

一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小石吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

26. 应该每次做标准曲线吗？

建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别作标准曲线。

27. 有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应简介反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。

28. 实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？

建议使用一个孔做一下检测，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式试验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常情况的O.D值应该在0.4以下。