免疫沉淀（IP）操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads 孵育；抗体-agarose beads 复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP 实验过程中遇到问题解答提示：

1、高背景

1.1 不溶性蛋白残留

离心后去掉上清。

1.2 洗涤不充分

盖上离心管盖反复颠倒数次

1.3 非特异性蛋白与珠子结合

珠子用BSA预封闭不充分，新鲜珠子与含1%BSA 的 PBS孵育1小时，使用前 PBS 洗涤3-4次

1.4 抗体特异性不够

使用亲和纯化的抗体，最好预先吸收

1.5 使用过量抗体

核对推荐抗体用量

1.6 细胞裂解液中含有太多细胞及蛋白质，导致洗脱液中含有额外假阳性蛋白质

减少细胞数量/裂解液使用。推荐使用10-500ug细胞裂解液

1.7 蛋白与抗体非特异结合

减少上样珠子的样本数量，使用同种来源和相同免疫球蛋白亚类的无关抗体达到预清除裂解液的效果

1.8 抗原降解

确保样品裂解时加入新鲜的蛋白酶抑制剂

2、大量抗体被洗脱

2.1 太多抗体与目标蛋白质洗脱

减少抗体用量，使用温和的甘氨酸缓冲液梯度洗脱

3、未检测到目的蛋白洗脱

3.1 样品不表达或低水平表达目标蛋白质

检查目的蛋白表达谱，确保其会在目的样品中表达，若低表达，可增加裂解液的使用量

3.2 无足够抗体捕获目标蛋白

核对抗体推荐使用量

3.3 目标蛋白未从珠子上洗脱

确保洗涤液配置正确

3.4 抗体未结合免疫吸附磁珠

确保使用的珠子与抗体亚型匹配

3.5 使用的裂解液不正确

核对说明书，确定抗体是否可以检测到变性蛋白质或天然蛋白质，并确保使用正确的裂解液。