形态学研究已经成为当前科学研究中最为看重的内容之一，其中形态学方面指标也是十分客观的指标，往往就是金标准。研究形态学的方法有多种，其中免疫组化技术是重要的方法之一，在科学实验中经常用到，已经渗透到医学研究的各个领域。在实验过程中实验者经常会碰到如下的问题，该如何解决？

1、无染色

1.1 一抗与二抗不匹配

使用针对一抗的二抗

1.2 无足够的一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度的一抗，并延长抗体孵育时间

1.3 抗体天然结构受损，不适合做IHC

用天然（非变性的）WB 方法检测抗体，确保抗体完好

1.4 由于不当储存、稀释或反复冻融造成抗体失效

做阳性对照排除抗体失效

1.5 靶组织中午目标蛋白

参照抗体说明书做阳性对照

1.6 组织中无足够的目标蛋白

应用信号放大操作

1.7 无避光保存二抗

避免将荧光二抗处于光照中

1.8 脱蜡不彻底

延长脱蜡时间，更换二甲苯

1.9 国定步骤中修饰了抗体识别表位

抗原修复暴露抗原表位，并适当缩短固定时间

1.10 目标蛋白位于核内，抗体无法穿透膜

在封闭剂及抗体稀释液中加入通透剂

1.11 PBS 缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

在抗体稀释液及PBS中可选择加入0.01% 叠氮化合物，或使用新鲜 PBS

2、高背景

2.1 没有封闭非特异结合或封闭不充分

延长封闭时间，并考虑更换封闭剂，建议使用10% 正常血清封闭1小时，或1-5% BSA 封闭培养细胞30分钟

2.2 一抗浓度过高

寻找最佳抗体稀释比，或在低抗体浓度中延长孵育时间

2.3 孵育温度过高

4°孵育

2.4 二抗发生非特异结合

不加一抗，做二抗对照

2.5 样品洗涤不彻底，有固定剂残留

充分洗涤

2.6 存在内源性过氧化物酶活性

使用酶抑制剂，如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑，或抑制过氧化物酶的H2O2

2.7 固定过度

改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间

2.8 信号过度放大

缩短信号放大时间，稀释信号放大试剂盒

2.9 底物过量

缩短底物孵育时间

2.10 染料与 PBS 在样品中相互作用

用 Tris 缓冲液冲洗切片，再与底物孵育，孵育后再次冲洗

2.11 通透作用破坏膜并去除了膜蛋白

去除缓冲液中的通透剂

3、非特异性染色

3.1 抗体浓度过高

降低抗体浓度，缩短孵育时间

3.2 存在内源性过氧化物酶

使用酶抑制剂，如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑，或抑制过氧化物酶的H2O2

3.3 一抗与被染组织同源，加二抗后，二抗与同源组织结合

使用与组织费同源的一抗

3.4 切片/细胞变干

保持切片/细胞湿润。