经过繁琐的蛋白印迹操作后，想要得到一张漂亮、清晰、无杂带、背景干净的图片有一定挑战。实验者经常会碰到如下的问题，该如何解决呢？

1、无信号

1.1 一抗和二抗不匹配

二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）

1.2 无足够的一抗或二抗结合的目标蛋白

使用高浓度的抗体，延长4°孵育时间

1.3 一抗不识别检测物种的蛋白

参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，同时设置阳性对照。

1.4 封闭剂与一抗或二抗有交叉反应

使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（如常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）

1.5 抗原量不足

每泳道蛋白上样量不低于20-30ug,使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照

1.6 样品中目的蛋白含量低

浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白需使用核裂解物）

1.7 转膜不充分

使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果，检查转膜操作是否正确。PVDF 1.8膜需预先在甲醇中浸泡。

1.8 洗膜过度

勿过度洗膜

1.9 过度封闭使目标蛋白不显色

使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，或更换封闭试剂，减少封闭时间

1.10 一抗失效

使用新鲜抗体，重复使用抗体有浓度会下降

1.11 二抗受叠氮钠抑制

避免使用叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用

1.12 检测试剂盒过期或底物失活

使用新鲜底物

2、背景高

2.1 未进行非特异封闭或封闭不充分

延长封闭时间，更换封闭试剂，推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟

2.2 一抗浓度过高

稀释抗体至合适浓度

2.3 二抗与封闭试剂非特异结合或反应

设置二抗对照（不加一抗）

2.4 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

在孵育和洗涤的过程中加入吐温-20，使用 BSA 代替脱脂奶粉

2.5 未结合蛋白洗涤不充分

增加洗涤次数

2.6 膜的选择不当

NC 膜比PVDF 膜背景低

2.7 膜干燥

避免在操作中膜干燥

3、多带现象

3.1 细胞传代次数多，使其蛋白表达不同

使用原始未传代的细胞株，和实验样品做平行对照比较

3.2 体内表达的蛋白具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等

查阅文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化等来验证翻译后的修饰

3.3 检测到未经报道的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白

查阅文献，或BLAST 搜索，使用说明书中推荐的细胞株或组织

3.4 一抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合

降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）

3.5 抗体未经纯化

使用亲和和纯化的抗体，减少非特异性

3.6 条带为非特异性条带

应用封闭多肽来区分特异和非特异性条带，只用特异性条带被封闭从而消失

3.7 靶蛋白形成多聚体

SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸10分钟，使蛋白质解聚

4、背景有不均匀的白色斑点

4.1 转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均

转膜过程中尽量去掉气泡，抗体孵育时保持摇晃

5、背景有黑色斑点

5.1 抗体结合了封闭剂

过滤封闭剂

6、深背景出现白色条带

6.1 一抗或二抗加入过多

稀释抗体浓度

7、蛋白标准条带呈黑色

7.1 抗体和蛋白标准发生反应

在蛋白标准和样品中间增加一个空白条带

8、目的条带染色过低/过高

8.1 分离不彻底

改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度较，分离量小的蛋白用高浓度胶

9、“微笑”条带，“哑铃”条带

9.1 迁移过快

9.2 电泳温度过高

10、相同的蛋白杂交出现大小不均一条带

10.1 制备凝胶时凝固过快，致使泳道中丙烯酰胺比例不均一

11、条带拖尾

11.1 蛋白上样量过大

11.2 抗体浓度过高

11.3 抗体孵育时间太长

12、出现非均一背景

12.1 膜在操作的过程中干过

13、条带出现重影

13.1 荧光强度过高

13.2 压片时移动位置

14、条带连成一条线

14.1 上样量太多

14.2 电泳长时间停止

14.3 样品弥散。