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ELISPOT技术的优势

时间:2017-07-18 09:27:09 浏览:

酶联免疫斑点(ELISPOT)技术是当今世界上检测生物体细胞免疫水平的最佳技术。它集高灵敏度、高可信度、高通量、单细胞水平、功能性检测与低成本等诸多优点于一身,在国内外免疫学界获得了广泛的应用,成为主流免疫学检测技术之一。我们来一一详述这些优点。

一、灵敏度高

理论上,ELISPOT高达百万分之一,也就是说哪怕一百万个阴性细胞中只有一个阳性细胞,ELISPOT能把这个阳性细胞检测出来。说来也没什么神奇之处,只要细胞状态好,阴性细胞就不会产生斑点。而有一个阳性细胞,就会产生一个斑点,反过来,一个斑点就证明了一个阳性细胞的存在,样哪怕这个阳性细胞混杂在一百万个阴性细胞中,ELISPOT能把这个阳性细胞检测出来。

实践中,由于一个ELISPOT孔容纳不了100万细胞,最多只能放万细胞。再者,50-60万阴性细胞出一两个自发斑点也算正常,所以实验组的孔要想有显著的统计学意义,需要出4-5个斑点。这也就是说,只要阳性细胞频率大于4个/60万细胞,就可以被ELISPOT检测出来。这算出来的实际灵敏度为十五万分之一。这样的灵敏度在一般客户的实验室都能达到,如果实验再精细一些,细胞处理得再好一些,灵敏度还可以提高一倍,达到三十万分之一。作为对比,采用流式细胞仪的方法(细胞内细胞因子染色法),对于阳性细胞的检测灵敏度只有千分之一,比ELISPOT技术要低两个数量级!

二、单细胞水平

与流式技术一样,ELISPOT也是一种单细胞水平的检测。作为对比,ELISA法、51Cr释放法、细胞增殖实验法都是群体水平的检测。如果群体细胞因子水平提高,既有可能是分泌细胞因子的细胞数量增加,也有可能是分泌细胞的数量没增加而单个分泌水平增加。这种区别对研究生物体的细胞免疫是很重要的,但是群体水平的检测不能区别出来,只有单细胞水平的检测能够胜任。也就是说,单细胞水平的检测可以提供更多的信息。

三、功能性检测

ELISPOT检测到的细胞因子不是实现存在的,而是在检测的过程中,被加入的刺激物刺激而分泌出来的。斑点的强弱和数量反映了细胞对刺激物的反应能力和分泌细胞因子的能力,这是体现细胞免疫反应的最重要的功能指标。作为对比,ELISA只能检测细胞的遗留物,充其量就是间接的反映了细胞功能。而流式细胞内细胞因子染色法需要的把本该分泌出来的细胞因子人为的囚禁在细胞之内,因能反映细胞应对刺激生产细胞因子的能力,不能反映其分泌细胞因子的能力,毕竟细胞因子要分泌到包外才能发挥功能活力。另外,流式方法也不能去除一类假阳性细胞,这类细胞的细胞因子含量丰富,但是没有分泌功能。

四、实现高通量检测

ELISPOT是在96孔微孔板上进行的,是一种高通量的检测与筛选方法。一位有经验的实验者一次可以处理上百份细胞样品与数十种抗原,测定它们的反应强度。作为对比,流式方法的样品细胞需要在独立的离心管中进行,远未实现高通量,工作效率要低很多。

五、直观,可信度高

相对ELISA法、流式细胞因子染色法、测CTL的51Cr释放法而言,ELISPOT是最直观的方法,一个阳性细胞一个斑点,清清楚楚,毫无疑问。只要实验遵循标准化的操作方法,该检测的重复性很好。另外,ELISPOT检测的样品细胞可以在液氮里面长期冷冻存放,治疗(或者免疫)前后的细胞可以做对比检测,细胞免疫水平的变化一目了然,可信度高。

六、检测成本低

流式方法需要昂贵复杂的流式细胞仪,但是ELISPOT检测并不需要特殊的仪器设备,充其量在检测规模扩大了之后需要购置全自动的斑点图像分析仪。另外,ELISPOT试剂相对于ELISA与流式抗体也要便宜很多。

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