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抗体及其使用的基本知识

时间:2017-12-13 22:19:16 浏览:

第一章:抗体和抗体的结构

 

抗体,也叫免疫球蛋白 (Ig),是一种能特异性结合抗原的糖蛋白,而抗原是在易感染动物体内引发抗体产生的物质。在体内,抗体是由于外源性分子的侵袭而产生的。抗体以一个或者多个 Y 字形单体存在,每个 Y 字形单体由 4 条多肽链组成,包含两条相同的重链和两条相同的轻链。轻链和重链是根据它们的分子量大小来命名的。Y 字形结构的顶端是可变区,为抗原结合部位。 任何一个抗体的轻链都可以分为κλ型(基于小分子多肽结构上的差异),每一个抗体的重链则决定了它的类或型。

 

重链  

 

哺乳动物 Ig 的重链一共有五种,分别用希腊字母αδεγ μ 来命名,相对应组成的抗体就称为 IgAIgDIgEIgG IgM 五种抗体。不同的重链在大小和组成上有所区别,αγ包含大约 450 个氨基酸,而 μ ε则有大约 550 个氨基酸。

 

每个重链有两个区:恒定区和可变区。所有同一型的抗体其恒定区都是相同的,不同型的抗体之间则存在差异。重链γαδ的恒定区的 组成为 3 个前后串联的 Ig 结构域,并有一个铰链区增加它的灵活性;重链 μ ε的恒定区则由 4 Ig 结构域组成。不同 B 细胞产生的抗体 其重链的可变区不同,但同一种 B 细胞或细胞克隆产生的抗体其可变区则是相同的,每一个重链的可变区都是大约 110 个氨基酸长度,并组成一个单独的Ig 结构域。

 

轻链

 

哺乳动物只有两种轻链:λ型和κ型,每条轻链有两个前后相连的结构域:一个恒定区和一个可变区。轻链的长度大约为 211~217 个氨基酸,每个抗体包含的两条轻链总是相同的,对哺乳动物来说每一个抗体中的轻链只有一个型:κλ型。在一些低等的脊椎动物中,像软骨鱼类(软骨鱼)和硬骨鱼类体内也会发现其他型的轻链如ι(iota) 型。




根据Y形结构的数量和重链种类的不同,哺乳动物体内的抗体可以分为 5 类:IgGIgMIgAIgDIgE,它们的重链分别是γμα δε。各类抗体在生物学特性、功能区域以及结合不同抗原的能力上有所不同,如下表所列:

 

/亚类

重链

轻链

分子量(KDa

结构

功能

 

IgA1

α1

λκ

150-600

单体-四聚体

最常引发的免疫球蛋白主要产生于粘膜部位,如肠道、 呼吸道和泌尿生殖

 

 

α2

系统,阻止病菌在黏膜的定居,能抵 抗消化并可分泌至乳汁中。

 

IgA2

 

 

 

 

IgD

δ

λκ

150

单体

功能不详;与 IgM 共同存在于 B 细胞发育的各个阶段;大部分与 B 细胞结合。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IgE

ε

λκ

190

单体

结合变应原引发巨细胞释放组胺,可引起变态反应, 也可以对抗寄生虫感染。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

IgG1

γ1

 

 

 

血清中最主要的免疫球蛋白。在免疫反应中提供 最主要的抗体以抵御病原

 

IgG2a

γ2

 

 

 

 

λκ

150

单体

菌的侵袭,温和的补体 固定剂 (IgG3);可通过胎盘。

 

IgG2b

γ3

 

 

 

 

 

 

IgG3

γ4

 

 

 

 

 

IgG4

 

 

 

 

 

 

IgM

μ

λκ

900

五聚体

最早产生的反应性抗体,在 B 细胞表面表达,分泌型有 很高的亲和力。在

 

B 细胞介导的免疫反应早期、产生足 够的 IgG 之前发挥作用,消除病原菌。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

鸡的 IgY

 

 

在生产多克隆抗体时,选择鸡会比兔和羊有更大优势。

 

 

1. 鸡不是哺乳动物,因此更易产生针对哺乳动物抗原的高亲和性抗体(特别是高度保守的哺乳动物蛋白)。

 

 

2.  众所周知,这是产生多克隆抗体的最合乎伦理的途径,不需鸡血,只要简单收集鸡蛋就可以。我们的母鸡是以六只一组喂养,而我们有独特的辨认鸡蛋系统,使鸡能自由走动。

 

 

3.  一只鸡就可以产生大量抗体,每个月大约可达 3 IgY,是兔子的 10-20 倍,而且与兔子相比,鸡产生抗体的周期更快,早在第 25 天就 可以从鸡蛋中获取高滴度的抗体。

 

4.  由于 IgY 存在于鸡蛋中,而鸡蛋可以收集起来并长期储存,还可以根据不同批次抗体的滴毒和/或亲和力来追溯性的从鸡蛋中纯化我们想要 IgY

 

喂养和修建鸡舍的费用低于兔子。  

 

  IgY 是一种很稳定的抗体,具有以下和哺乳动物 IgG 相同的特征:  

 

  二价

 

  可被木瓜蛋白酶降解成二价 Fab 片段

 

  通过标准程序可以进行酶标记、生物素标记和金标记

 

 

7. IgY Fc 片段与哺乳动物的 IgG 有明显的不同

 

  不会结合哺乳动物的类风湿因子或其它自然产生的抗哺乳动物抗体的抗体(如 HAMA),从而降低实验背景

 

  不会激活哺乳动物的补体系统

 

  不会结合哺乳动物的 Fc 受体

 

  不会结合金葡菌蛋白 A 或蛋白 G

 
 
第二章:抗体形式及抗体纯化  

 

对于血清、腹水和组织培养上清的澄清,离心和过滤是基本的实验室技术。这些技术可以去除会阻塞层析柱的脂类和小颗粒物质。对于某些样品,缓冲液置换和除盐也是必要的步骤。硫酸铵沉淀作为更进一步的预处理步骤,经常用于浓缩腹水中的免疫球蛋白。

 

抗血清

 

多克隆抗体通常是未经纯化的,称为血清或抗血清。抗血清是指已经除去了凝血蛋白和血红细胞的免疫宿主的血液。抗血清包含所有种类的抗体/免疫球蛋白以及其它血清蛋白。它所包含的不仅有识别靶抗原的抗体,还有识别非靶抗原的抗体,在免疫分析中有时会发生非特异性反应。由于这个原因,粗制抗血清通常要进行纯化,以去除血清蛋白,增加能特异和靶抗原相结合的免疫球蛋白的比例。

 

组织培养上清

 

单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞培养(细胞分泌性抗体)并收获杂交瘤组织培养上清来获得。

 

腹水

 

单克隆抗体可以通过在小鼠(或大鼠)的腹腔中生长杂交瘤细胞而产生。杂交瘤细胞注射入小鼠以后,就会在小鼠腹腔繁殖并产生液体(腹水)。这种腹水就包含了高浓度的可收获抗体,比杂交瘤细胞培养有更高的抗体产量。

 

抗体纯化

 

多克隆抗血清或单克隆腹水/组织培养上清通常通过下述三种方法中的一种来进行纯化:

 

  1. 蛋白A/G纯化

     

    蛋白 A/G 纯化是应用金黄色葡萄球菌的蛋白 A 或链球菌的蛋白 G 对免疫球蛋白 Fc 段的高亲和性。蛋白 A/G 纯化从粗制抗血清中去除了血清蛋白,但没有去除非特异的免疫球蛋白组分。结果蛋白 A/G 纯化的抗血清仍然具有一小部分不期待的交叉反应性。

     

    1. 亲和纯化

       

      亲和纯化就是通过相似性分离某一特定蛋白或具有相似特征的一组蛋白。这种分离蛋白的技术是基于在蛋白和耦合于层析介质上的特定配基之间的一种可逆的相互作用。 抗原亲和纯化的优势是免疫球蛋白能够特异性地同刺激它产生的抗原进行结合,结果消除了大量的非特异免疫球蛋白成分,将能特异与靶抗 原相结合的免疫球蛋白成分富集。因此亲和纯化后获得的主要是含所期待的特异性免疫球蛋白。

       

  1. 预吸附

     

    多克隆抗体有时要经过预吸附。也就是说它们要被不同物种来源的其它蛋白或血清吸附,以消除可能的交叉反应的抗体。这样纯化后的抗体纯度和特异性应很高,任何交叉反应都被显著减少。

    第三章:抗体选择和稀释比度

     

    对于任何一种特定的靶抗原,都有不止一种有效抗体。为了缩小选择范围,实验中通常要考虑以下几个方面:

     

  1. 分析或者应用类型

     

  2. 样品的性质

     

  3. 样品的种类

     

  4. 抗体宿主的种类

     

  5. 抗体的标记和检测

     

    用途

     

    抗体数据表所显示的用途都是已经得到检测证明可以发挥作用的。如果某项用途没有列出,并不意味着抗体不合适,而是还没有检测是否有该项用途或不知道抗体如何发挥作用。如果已经检测并证明无效也会在表中列出。

     

    样品的性质

     

    样品的性质会告诉您哪个抗体最合适,至少要考虑以下两个方面:

     

  1. 要检测的蛋白区域。刺激宿主动物产生抗体的具有免疫原性的物质种类繁多,包括全长的蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物机体(例如细菌)或细胞。免疫原通常在数据表中会有显示(尽管在很多例子中由于专利原因找不到关于免疫原的详细描述)。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域,那就要求选择的抗体是由该特异片段或区域或者包含该特异片段或区域的免疫原刺激产生的。如果要通过 FACS 去检测活细胞表面蛋白,则要求选择的抗体是由蛋白的细胞外区域刺激产生的。

     

  2. 样品的处理工艺。有些抗体要求样品先进行特殊处理。例如,许多抗体只识别降解或变性蛋白,可能因为这样会暴露藏在二次或三次折叠后蛋白内部的抗原表位。另一方面,有些抗体仅识别自然折叠状态蛋白上的表位。(Abcam 公司用于 western blotting 的抗体,样品都需进行降解和变性处理,除非在数据表中特殊标明)。当搜寻用于免疫组化的抗体时,则应注意有些抗体只适合用于未固定冷冻组织。有时,抗原修复步骤则必不可少,这样可以消除由福尔马林固定所引起交联,因为有些抗体不能结合福尔马林固定和石蜡包埋组织中的靶目标。在数据表的应用章节会明确指出上述限制。

     

    样品种类

     

    尽管由于具有足够多的同源氨基酸序列,抗体可以和其它物种的同一靶蛋白反应,但是我们选择的抗体仍然应该是来源于同一物种的抗原刺激产生的。如果样品不是来自于列表所示的物种之一,也不能说明该抗体不可以用来检测这种样品,而可能是来自该物种的样品没被检测过,因此我们很难推荐它的适用性。根据序列相似性可以预测交叉反应性:值得骄傲的是 Abcam 在数据列表里有 ExPASy NCBI BLAST 的链接,可以比对不同物种来源氨基酸序列的同源性。

     

    选择抗宿主的类别

     

    一般来说,当用标记二抗来检测非标记一抗时,产生一抗的宿主动物的类别就非常重要。对于免疫组化,产生一抗的宿主应尽可能的和样品的宿主种类不同,以避免二抗的免疫球蛋白与样品中内在的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。例如,用于检测鼠源蛋白的一抗就不应来源于鼠或大鼠,来源于兔则是比较适合的选择,接下来用检测分子(酶、荧光、生物素等)标记的抗兔 IgG 的二抗进行结合。如果有已标记的一抗则可以直接避免上述交叉反应发生。对于不含内源性免疫球蛋白样品的检测,宿主的种类选择不用很严格。例如进行 western blotting 的细胞裂解液就被认为不包含 IgG。而组织溶解液和组织培养上清(包括血清)则被认为是含免疫球蛋白的。Western blotting IgG 会以 50 25kDa 的条带出现在降解和变性样品中,分别相当于 IgG 分子的重链和轻链。

     

    选择二抗

     

    二抗应来源于抗一抗的物种。举例来说,如果您的一抗来源于鼠,那么二抗就应该选择抗鼠的。我们建议仔细核对二抗数据表以确定您要使用的二抗。

    Abcam提供有大量标记各种荧光物质和染色物质的二抗。

     

    检查您所用的一抗数据表的底部,将会显示一些合适的二抗。

     

    为了找到您自己的二抗,可以使用我们的导航框或通过主页中心的链接来选择产品类型,然后选择您一抗的种类,这样会显示大量适用于一抗种类的二抗。

     

    双重染色抗体的选择

     

    对细胞培养液或组织上清液进行双免疫染色要求非标记一抗来源于不同物种的动物,而二抗则特异性识别其中一种一抗。二抗如果与其他动物来源的免疫球蛋白有交叉吸附,则会在数据表中明确说明。

     

    荧光和染料标签

     

    标签结合在抗体上使抗体的结合可见。标签的选择依据以下几个方面

     

  1. 检测方法:荧光或有色沉淀。荧光标签会在特定波长的光激发下发光。根据它们自己激发和发光性质不同,有一些荧光标签是可用的。在结合了合适的底物时,酶标签HRPAP可以形成有色沉淀。

  2. 有效的封固剂(只限免疫组化):AECFast RedINT或是其它的水溶性染色剂均溶于酒精,因此要求使用水溶性封固剂。以上提到的其他有机物要想得到较好的折射率,最好使用有机封固剂封固。

    荧光素标签需要水溶性封固剂。胆藻素蛋白(藻青蛋白/藻红蛋白)需要不加甘油的水溶性封固剂,否则会产生淬灭效应。

     

  3. 生物素标记的抗体对于信号的放大是很有效的,比如可应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物(通常缩写为ABC试剂)或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法。

     

     

    未纯化抗体的建议稀释和浓缩

     

    未纯化抗体在某一特定抗体浓度下会发生很显著的变化。如果不清楚给定的未纯化抗体样品的浓度,就可以参考下面的特殊范围作为估计的指导。

     

 

组织培养上清

腹水

全抗血清

纯化的抗体

 

 

 

 

 

WB/斑点杂交

1/100

1/1000

1/500

1μg/ml

IHC/ICC

纯度达到 1/10

1/100

1/50-1/100

5μg/ml

EIA/ELISA

1/1000

1/100000

1/500

0.1μg/ml

FACS/流式细胞术

1/100

1/1000

1/500

1μg/ml

IP

-

1/100

1/50-1/100

1-10 μg/ml

 

 

 

 

 

浓度估计

1-3 mg/ml

5-10 mg/ml

1-10 mg/ml

 


声明:以上内容由Abcam公司提供。


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