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ELISA 即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题，我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结如下：
一、实验样本的采集及保存方法
收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月。-70度可保存6个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。
◇液体类标本：
标本必须为液体，不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。1ml的全血 可得到0.5ml的血清或血浆。每个标本量收集体积＝100ul×检测种类。
◇血清：
室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。 ◇血浆：应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入10％（v/v）抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1%heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
◇尿液、胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液：
用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
◇细胞培养上清：
检测分泌性成分，无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时， 用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。 离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
◇组织标本： 切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，缓冲液中可加入1μg/L蛋白酶抑制剂或50U/ml的Aprotinin（抑肽酶）。 用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清置于-20度或-70度保存。如有必要， 可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
二、实验过程中遇到的问题：
问题一：高背景或阴性对照值偏高
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可能原因 |
建议 |
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阴性对照孔被阳性对照或样品污染 |
洗涤时，勿将洗液溢出孔外 |
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抗体非特异性结合 |
封闭液不适合，更换封闭液 |
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酶结合物过浓 |
请检查酶结合物是否按说明书规定稀释 |
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孵育温度过高 |
检查孵育箱的温度是否正确、稳定 |
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底物在使用前曝光 |
应保存在暗处，避光 |
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读板前停留时间过长 |
加终止液后3分钟内读数 |
问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
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可能原因 |
建议 |
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试剂未平衡至室温 |
实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温 |
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检测体积偏小 |
检查移液器吸液管道是否堵塞 |
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孵育时间过短 |
使用计时器，准确孵育时间 |
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底物受污染 |
使用新配置的试剂，重新实验 |
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包装袋中有湿气 |
检查袋中是否有干燥剂 |
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样本中有抑制剂 |
叠氮钠会抑制HRP酶的活性 |
问题三：边缘效应
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可能原因 |
建议 |
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蒸发 |
各步之间，须使用封版胶密封反应板 |
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温度不均匀 |
校准孵育箱，勿叠放反应板 |
问题四：标准曲线不佳
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可能原因 |
建议 |
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倍比稀释标准品时未混匀 |
稀释标准品的每一步均需混匀 |
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过早稀释 |
标准品在快要使用时稀释 |
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加入的体积不正确 |
使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中 |
问题五：标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号
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可能原因 |
建议 |
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样本中无检测物或检测物含量极低 |
设置内参，重新实验 |
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样本中其他物质影响/掩盖检测 |
作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率 |
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样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值 |
适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内 |
问题六：重复性较差
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可能原因 |
建议 |
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微孔中有气泡 |
用针尖挑破气泡 |
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试剂未混匀 |
确保充分混匀试剂 |
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样本中有杂质或沉淀物 |
使用前离心 |
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微孔包被面被吸头划破 |
加液时小心操作 |
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使用用过的封板胶纸 |
每次须使用新的封板胶封住反应孔 |
问题七：假阳性反应
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可能原因 |
建议 |
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洗涤不充分 |
使用前需检查洗板机是否正常工作 |
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洗板机管道堵塞 |
需经常维护洗板机 |
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加结合物时，洒在微孔边缘 |
小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触 |
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检测样本中含有红细胞 |
离心 |
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微孔中液体挥发 |
用封板胶密封反应孔，置于湿盒内 |
问题八：整块板产生阳性OD值或整个板显蓝色
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可能原因 |
建议 |
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洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染 |
洗涤时，缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外 |
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结合物浓度过高 |
检查是否按照说明书推荐比例稀释 |
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血清中有血清因子 |
勿加热血清 |
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底物容器不洁净 |
用酸清洗容器瓶，用蒸馏水冲洗 |
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底物孵育时，微孔板曝光 |
加底物时，立即将板置于暗处 |
问题九：整块板OD值偏低
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可能原因 |
建议 |
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显色时间不足 |
适当延长显色时间 |
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孵育温度偏低 |
36度为最适反应温度（欣博盛ELISA试剂盒） |
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未加终止液 |
加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应 |
问题十：显色缓慢
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可能原因 |
建议 |
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样本未置于室温 |
实验开始前，将样本平衡至室温 |
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酶结合物活性减弱 |
检测稀释度 |
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酶活性收到抑制如叠氮钠 |
避免实验不当的防腐剂 |
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显色温度不适当 |
按说明书操作 |
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