在医学生物的科学研究中，体外细胞实验是必不可少的研究手段，研究者们常用的细胞包括：原代细胞、细胞系、细胞株。原代细胞因其细胞性状和生物学特性接近其生理学特性，故在科学研究中广泛使用。为何选择原代细胞及经常遇到的问题该如何解决？在这里，将会阐明。

一、使用原代细胞与使用细胞系相比的优势

能够大量扩增、永生化的细胞系（ HeLa, HEK 293, MCF-7, CACO-2, JURKAT, U937, CHO, COS-7,等）及其通用培养基如DMEM、RPMI的确在生命科学研究领域占有一席之地，但对于特殊的用途和研究意图，由于原代细胞固有的遗传变异特性会与细胞系出现的假阳性和阴性，次优细胞/配对培养基和数据错误相关。 

二、原代细胞与其优化培养基的特别之处

直接分离自新鲜组织的原代细胞与标准的永生化的细胞系或量产、通用的培养基（对于各细胞类型未经优化）不同，甚至更好。原代细胞是生理性相关的，但是对分离操作以及培养条件要求苛刻，每一个特殊的物种、组织、细胞类型配对相对应的特殊工艺。

三、当我们从公司购买原代细胞后，后续步骤实施

1、第一步. 仔细阅读产品说明书

因不同品牌、不同种属、不同类型的细胞其培养技巧存在些许差别，客户收到细胞后，请务必仔细阅读随货附赠的说明书，切记不可仅凭经验操作。

通常，我们可以从说明书中获取以下重要信息：

（1）细胞数目

（2）细胞增殖能力

（3）推荐培养基、培养器皿及包被材料（Coating Solution）

（4）推荐接种密度

（5）复苏、培养、传代等操作步骤

（6）运输及储存条件

2、第二步. 细胞复苏及原代培养

细胞复苏是关系后续细胞培养成功与否的关键步骤。不同品牌、不同种属的冻存原代细胞在复苏时可能有所不同，请严格按照说明书进行操作。

（1）选择合适的培养器皿，使用coating solution（poly-L-lysine、Fibronectin等，see the datasheet for specific details）进行包被，并置于37℃, 5% CO2/95% air培养箱中平衡过夜（至少1小时）。

（2）小心将装有细胞的冻存管从液氮罐取出，注意保护手和眼睛。

（3）将冻存管的盖子拧松1/4圈，等待10秒，释放盖子内可能残留的液氮，然后重新旋紧盖子。

（4）将冻存管置于37℃水浴锅内（注意不要把冻存管完全浸没在水中），轻摇冻存管直至内容物几乎完全溶解（只剩一些非常小的冰晶残留在管内）。此过程大约需要1-2分钟。

注：水浴融化时间过长会给细胞带来损伤，导致不贴壁。

（5）迅速将冻存管自水浴锅中取出擦干，用70%酒精擦拭冻存管外表面，然后转移至超净台内。

（6）在超净台内拧开冻存管的盖子，小心手指不要碰到管口，用1ml移液枪轻轻吹打重悬内容物，然后加入10倍以上内容物体积的培养液制成细胞悬液。

注：复苏后的内容物含有冻存液DMSO残留，不同品牌对待是否有必要离心去除DMSO残留这一问题意见不一，请务必严格按照说明书进行操作。

某些品牌，例如Sciencell、Cell Applications等明确规定，不允许将细胞离心以去除DMSO残留。因为离心过程尤其是高速离心，给细胞造成的危害远远大于DMSO残留给细胞造成的影响。通常，按照说明书上推荐的培养基用量将内容物进行稀释后，DMSO浓度已经降到很低，不会给细胞造成损伤。

而有些品牌例如ATCC，推荐客户使用125g离心力离心10分钟，弃上清，以去除DMSO残留，然后用1或2ml完全培养基重悬细胞。

（7）按照说明书推荐接种密度将细胞悬液分别加入到若干个事先包被过的培养器皿内。

注：绝大多数原代细胞培养起始接种密度介于103-104 cells/cm2。对于某些增殖速率较高的细胞类型，通常以较低的接种浓度起始培养。详细接种密度请参照说明书。

（8）轻轻旋转培养器皿，使细胞悬液均匀分散开来。

（9）将培养器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培养箱培养。

注：绝大多数动物细胞系的最佳生长温度是37℃，极少数对温度敏感的动物细胞、昆虫细胞及两栖类动物细胞的生长需要相对低一点的温度（例如28℃）。虽然体外培养的细胞能够承受生存环境温度骤降，甚至绝大多数细胞在4℃仍能存活数天，但是极少有细胞能够在高于最适宜生长温度2℃的环境下存活几个小时。

（10） 6-16小时后，首次更换培养液，目的是为了去除残留的DMSO以及未贴壁的死细胞。

（11） 之后，视细胞生长情况，每隔2-3天换一次液，详见datasheet。