一、基本原理

二、FACS仪器特性

                 FACSCalibur  双激光四色                          FACSAria II双激光八色

三、FACS 样品准备

流式细胞仪分析和分选细胞时，有些问题的出现与仪器没有关系，而与样本制备如样本浓度、缓冲液（PBS）、细胞条件、活性、自发荧光及试剂选择有关。

-细胞处理：胰酶（消化贴壁细胞）；FBS胎牛血清培养细胞，中和胰酶 ；PBS用于细胞样品的清洗和重悬，维持细胞基本的PH平衡稳态。

-全血处理：淋巴细胞分离液

-组织处理：研磨消化

单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）5×105～1×106cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤

四、FACS-多色抗体选择

1、按照仪器设置

              FACSAria II双激光八色

2、染料的亮度与抗原表达相匹配

- 高表达的抗原可用不太亮的荧光染料

- 低/弱表达的抗原选用较亮的染料

        荧光染料的亮度                                        抗原表达

3、同种细胞的荧光染料重叠最小化

   （1） 采用多激光激发减少重叠 。

       同一细胞的抗原, 用不同激光激发减少重叠。例如：FITC/APC

   （2） 尽量避免双激发光荧光染料选择。

       荧光染料可被不止一个激光激发，导致光谱重叠干扰，影响结果。

       例：PE-Cy5  可被 Violet（405nm) 和Blue（488nm)

4、尽量避免偶联使用带来的假阳性

   PE/PE-Cy5, APC/APC-Cy7/APC-H7……

             避免染料和其衍生物（ tandem-dye）在同一细胞上标记，或者选用更稳定的tandem-dye！

五、FACS-上机检测

1、 仪器的校准

2、补偿的调节

调节荧光补偿的利器——荧光补偿微球

优点： 通常荧光都比样本表达要强 CV值小，几乎没有背景荧光和实际染色的荧光抗体结合不需要使用珍贵的样本使用简单 

软件自动补偿：新潮：新一代

              客观：准确的数字计算

              样品采集：简单化

                         可逆：轻松创建新的，修改旧的矩阵

3、细胞的定位和圈门

 六、结果分析