一、细胞凋亡检测

细胞凋亡背景：

为程序性细胞死亡，起因可能因为外界环境、生长发育等因素而导致自然死亡现象。当细胞发生 apoptosis 时， 会发生细胞膜 PS 由胞内外翻至细胞外、粒线体膜电位 改变、Caspase活化、DNA fragmentation ，一连串的反应使细胞裂解形成凋亡小体，被巨噬细胞识别并清除。

1、Annexin V binding assay / 破解细胞膜 PS 外翻

凋亡细胞在早期 Phosphatidyl-serine ( PS ) 会由细胞膜内外翻至膜外，利用 Annexin V 检测能让您作为最快速方便的 apoptosis 指标。以 Annexin V-FITC 标示外翻的PS，再合并以PI 进行死亡细胞的染色，以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin V-FITC 染成绿色， 但对PI 拒染； 已死亡或Apoptosis 后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin V-FITC 与 PI；健康的细胞则无法染上Annexin V-FITC 或PI。

• 只需15 分钟，让您快速检测早期 apoptosis 指标。

• 无须固定，活细胞即可检测。

• 可利用 Flow cytometry 或 immunofiuorescence 分析结果。

• 选择性多，可搭配Kit 或是抗体。

Annexin V 作用原理：

Flow 结果：

以 Annexin V-FITC 标示外翻的PS，再合并以PI 进行死亡细胞的染色，以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin V-FITC 染成绿色， 但对PI 拒染； 已死亡或Apoptosis 后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin V-FITC 与 PI；健康的细胞则无法染上Annexin V-FITC 或PI。

2、JC-1 assays / 破解粒线体膜电位改变

当细胞凋亡时线粒体膜电位的改变，会导致线粒体膜的通透性改变，使 Cytochrome C 释放至细胞质中，引发下游酵素反应活化，导致 Caspase 活化，造成一连串凋亡反应。

• 只需 15 分钟，可轻松快速染出粒线体膜电位的改变。

• 无须固定，活细胞即可检测。

• 利用 Flow cytometry 分析结果。

• All in one ，kit 内包含实验所需的试剂。

• 操作方便， kit 附有详细完整的 protocol。

JC-1 有两种形式：

1. 正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1 进入粒线体以多聚体 ( Aggregates ) 存在，FL2 channel 可观察到多数红色荧光

2. 细胞走向凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1 则以单体 ( Monomer ) 存在在细胞质，在 FL1 Channel 可以观察到绿色荧光的增加。

3、Caspase activity assay kits / 检测 Caspase 活化

当 Cytochrome C 释放至细胞质中，会导致 Caspase 活化，而活化的 Caspase 会引发一连串的蛋白质酶解作用( proteolysis cascade )，将凋亡信息送至更下游的物质，造成凋亡细胞的特征性型态改变。

• 利用 Flow cytometry 分析结果

• All in one ，kit 内包含实验所需的试剂

• 操作方便， kit 附有实验 protocol

4、APO-BrdU & APO-Direct / 检测 DNA fragmentation 现象( TUNEL Assay )

• 利用 Flow cytometry 分析结果。

• 适用 adherent cells & suspension cells。

• 可搭配 cell cycle analysis 一并利用 Flow cytometry 分析结果。

APO-Direct Assay 作用原理：

Flow cytometric analysis of APO-Direct staining.Positive control cells (human lymphoma cell line stimulated to undergo apoptosis, bottom row) and negative control cells (untreated lymphoma cell line, bottomrow), both included in the BD APO-Direct Kit (Cat. No. 556381), were stained according to the kit insert. Samples were collected for 30 seconds on fast speed on a BD Accuri C6 flow cytometer, and data was acquired using BD Accuri C6 software. Clumped cells were excluded by gating on the DNA Area vs Height plot (middle plots). Results: The positive control cells showed a significant increase in apoptotic cells (R1) compared to the negative control.

APO-BrdU Assay 作用原理：

Flow cytometric analysis of APO-BrdU staining.Positive control cells (human lymphoma cell line stimulated to undergo apoptosis, bottom row) and negative control cells (untreated lymphoma cell line, top row), both included in the BD APO-BrdU Kit (Cat. No. 556405), were stained according to the kit insert. Samples were collected for 30 seconds on fast speed on aBD Accuri C6 flow cytometer, and data was acquired using BD Accuri C6 software. Clumped cells were excluded by gating on the DNA Area vs Height plot (middleplots). Results : The positive control cells showed a significant increase in apoptotic cells (R1) compared to the negative control.

二、细胞增殖检测 

BD Pharmingen - Cell proliferation 研究工具

1、BrdU 标定分析

• 利用 Flow cytometry 分析结果。

• 可与其他抗体一起进行染色，实验设计更弹性

• 可用于 96-well plate 的染色分析

• Ready to use : kit 已包括实验所需的抗体、buffer 和 protocol

2、 BD Horizon ™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450)

BD Horizon ™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450) 是种紫激光( violent laser ) 激发的酯化染剂，可以用流式细胞仪分析的方式，来检测单一细胞的细胞分裂(cell division) 的情况。

• 检测 cell proliferation。

• 实验弹性 : 可适用于 fixation and permeabilization

• 紫激光 ( violent laser )激发 : 荧光配色更多元，可检测GFP transfected cells，增加 FITC、PE 等荧光配色

VPD450作用原理：

VPD450 是非荧光形式的染剂。其酯基 (ester group) 的部分可以让它以被动运输的方式进入到细胞内。当 VPD450进入到活细胞内的时候， 酯酶 (esterase) 会使其酯基裂解，使 VPD450 转变成发荧光型式并以 succinimidyl estergroup 共价键结细胞内的蛋白质的胺基 (amine group)。而死细胞就不会发荧光。当活细胞分裂的时候，VPD450 会平均分配到两个子细胞里面；每一个子细胞所含的荧光量大约为原本母细胞的荧光量一半。VPD450 与细胞内蛋白质的共价键结非常坚固，即使细胞经过固定、打孔等步骤，VPD450 仍可以维持在细胞内。

CD4+ enriched mouse splenocytes 加入1 μM VPD450。10 分钟后，细胞用 anti-CD3/CD28（货号：553057、553294） 刺激。在收集细胞前的 4-6 小时，细胞加入 PMA 和 Ionomycin、BD Golgi-StopTM (protein transport inhibitor)（货号：550583） 。 细胞在固定、打洞后，进行 IL-2 染色。

3、 PI/RNase Staining Buffer   (RUO)

PI是一种染色DNA和RNA 的重要荧光染料。PI先与DNA和RNA结合后，核糖核酸酶将其消化。通过流式细胞术检测DNA的含量,进而可检测在细胞周期调控过程中细胞周期及蛋白信息。处于细胞周期中G2和M阶段中DNA含量是G0和G1阶段的双倍，而处于S期阶段中DNA含量处于以上二者中间。PI推进使用562 - 588 nm广谱范围，这种试剂可以用于流式细胞仪分析细胞周期。

Cat No.    550825

Brand       BD Pharmingen™

Application    Flow cytometry (Routinely Tested) 

Storage Buffer    Aqueous buffered solution containing ≤0.09% sodium azide.

Regulatory Status   RUO

三、细胞凋亡、DNA 损伤及细胞增殖检测

• 可同时检测细胞 proliferation、apoptosis、DNA damage

• 适用 human 和 mouse 的物种样本

• Ready to use : kit 已包括实验所需的抗体、buffer 和 protocol

•适用俩根激光 ( 488 & 635 Laser ) 之流式细胞仪检测，如 BD Accuri C6 和 BD FACSCalibur

四、细胞死活鉴定染料

BD HorizonTM Fixable Viability Stain (FVS) Reagents

为什么要鉴定细胞死活？

• 死细胞非特异性染色使细胞背景增高，影响检测灵敏度

• 鉴定细胞生命活性

• 死细胞假阳性染色结果影响真实验结果比例

与传统染料PI、7-AAD 相比优势？

适用于胞内染色的死活细胞鉴定

Fixable Viability Stain 适用于需要固定、破膜、洗涤、染色处理的细胞死活检测，而PI、7-AAD 检测细胞死活的染色过程是在其他抗体孵育完成后进行，不能洗涤即要上机检测；胞内蛋白染色，经过固定破膜，PI 或7-AAD 染色后所有的细胞都是阳性，所以PI、7-AAD 只适合于未固定细胞死活鉴定。

Fixable Viability Stain 的光谱多样，适合各种染色组合的搭配

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