双萤光素酶报告基因检测试剂盒

【产品介绍】

聚合美生产的双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase)，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化 luciferin 发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61kD 的蛋白，在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化 luciferin氧化成 oxyluciferin，在 luciferin 氧化的过程中，会发出生物萤光(bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为 36kD 的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化 coelenterazine 氧化成 coelenteramide，在 coelenterazine 氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。本试剂盒的检测原理参考下图。

通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或 5'启动子区克隆在 luciferase 的上游，或把 3'-UTR 区克隆在 luciferase 的下游等，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。Renillaluciferase 相对更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。萤火虫萤光素酶催化 luciferin 发光的最强发光波长为 560nm。海肾萤光素酶催化 coelenterazine 发光的最强发光波长为 465nm。

本试剂盒可以测定 100 个样品。

【组分】

报告基因细胞裂解液 60ml

萤光素酶检测试剂 10ml

海肾萤光素酶检测缓冲液 10ml

海肾萤光素酶检测底物(100X) 100µl

【储存温度】

报告基因细胞裂解液和海肾萤光素酶检测缓冲液在 4ºC 保存 1 个月有效，-20ºC 保存一年有效，-80ºC 可以长期保存；

萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测底物(100X)在-20ºC 避光保存 6 个月有效，-80ºC 避光保存一年有效。

【所需仪器和试剂】紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。

【操作步骤】

1. 裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。

a. 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

注：如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如 6 孔板的每孔用量可以最小为 100 微升。

b. 充分裂解后，10,000-15,000g 离心 3-5 分钟，取上清用于测定。

注：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

2. 融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100X)置于冰浴或冰盒上备用。

3. 按照每个样品需 100 微升的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照 1:100 加入海肾萤光素酶检测底物(100X) 配制成海肾萤光素酶检测工作液。例如，1 毫升海肾萤光素酶检测缓冲液中加入 10 微升海肾萤光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约 1毫升海肾萤光素酶检测工作液。

4. 按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为 2 秒，测定时间设为 10 秒。

5. 每个样品测定时，取样品 20-100 微升(如果样品量足够，请加入 100 微升；如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量宜保持一致)。

6. 加入 100 微升萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。

7. 在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入 100 微升海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定

RLU(relative light unit)。

图 2. 本试剂盒的检测效果。实际读数会因细胞数量、转染效果、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

8. 在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的 RLU 值除以海肾萤光素酶测定得到的 RLU 值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。

货号	规格	销售价
MF648-01	100T	1998.00
MF648-05	5×100T	8800.00

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