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【产品简介】

本品为超微量RNA提取的专用试剂盒。适用于从超微量的细胞、组织、昆虫、植物、细菌等样品中提取总 RNA。处理范围一般为细胞（1-10⁴）或者组织（< 5mg）。配有DNA酶柱上消化试剂，得到的RNA无DNA残留，可直接用于下游荧光定量PCR或者高通量测序等试验。

【产品特色】 

 1、无垫圈离心柱设计确保离心后无液体残留和污染。保证了回收RNA高纯度。

 2、微量10μg离心柱设计可以最低6μl洗脱，保证了提取RNA的高浓度。

 3、添加特殊植物RNA助提剂PlantMagic可以清除植物多糖多酚或者昆虫的糖原，几丁质多糖等杂质，提高富含杂质的昆虫和植物RNA的提取质量。

 4、不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

【储存条件】DNase Buffer DNaseI -20℃运输和保存，其他组分室温储存，12个月不影响使用效果。

【产品组份】 

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

【注意事项】

 1、所有的离心步骤均在室温完成。

 2、部分含多糖多酚、几丁质多糖或者次级代谢产物丰富的昆虫样品，或者植物样品，提取效果不佳（如降解、产量低）可以尝试在裂解液RLT中添加PlantMagic后提取。

具体添加比例为10体积（1ml）RLT：1体积（100μl） PlantMagic。

 3、关于DNA酶柱上消化的使用：

 1）普通RT-PCR：可以省略DNA酶柱上消化步骤。

 荧光定量RT-qPCR：

 A）可以加上DNA酶柱上消化步骤。下游采用不加基因组清除步骤的反转录试剂盒即可（如聚合美货号：MF012）。

 B）可以省略DNA酶柱上消化步骤。但是下游建议采用带基因组清除的反转录试剂盒即可（如聚合美货号：MF166-plus）。

 3）高通量测序/转录组测序：

 要求特别高的下游实验必须做DNA酶柱上消化步骤，或者按照高通量测序公司的要求进行。

 【操作步骤】

  <使用前请仔细阅读注意事项>

  <第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!>

 所有步骤室温操作，整个操作步骤是由三个步骤组成：样品裂解匀浆、样品清理和样品纯化。

 样品裂解匀浆

  组织：5mg以内的组织加300μl的裂解液RLT后匀浆。

  注意：PlantMagic是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分。

  其它组织：难裂解的组织，细菌，酵母，植物匀浆需配合高速珠磨均质仪器和适合裂解珠（玻璃珠，钢珠，锆珠等）。

   贴壁细胞：去除液体培养基后，直接往培养板中加入裂解液RLT溶解细胞，并用移液枪反复吹打充分裂解混匀。依据细胞的数量来决定所需的裂解液RLT（10⁵细胞以内加100μl，10⁶细胞以内加300μl）。

  悬浮细胞：离心沉淀细胞(≤500 x g)，完全去除上清后用裂解液RLT重悬细胞沉淀。可短暂涡旋振荡。

 样品清理

 <此步骤为可选步骤>

 主要是针对动植物组织和细胞，对于样品量很低（细胞数≤10⁴）)或者匀浆后能充分裂解均一的样品无需此步骤。

 若研磨匀浆后不溶物碎片太多，可将匀浆后裂解物13,000rpm离心1分钟沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物。

 将上清液转移到新的1.5ml离心管内。

样品纯化

 加入等体积(95-100%)的无水乙醇到上一步的裂解物上清中吹打混匀。

 将混合物加入一个微量RNA离心柱中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30 秒，弃掉废液。

 加700μl 去蛋白液RW1，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。

 将离心柱放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

 取出离心柱，放入一个干净5ml离心管中， 在吸附膜的中间部位加15μl RNase free water（事先在70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

 注意：减少洗脱液体积可以提高RNA浓度，但是最低洗脱液体积不应少于6 μl。

 附录1：DNA酶柱上消化

 按照前面所列试剂盒操作步骤操作，直到做完样品纯化的操作步骤2。

 取20μl DNase buffer和2μl RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液（处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液）。

 注意：DNase Buffer含Mn2+，可能有轻度发黄发黑，甚至黑色沉淀为正常现象，颠倒混匀后正常使用即可。

 向离心柱中加入350μl去蛋白液RW1，12,000 rpm 离心30 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

 向离心柱的膜中央加入前面准备的22μl的DNase I 工作液，室温（20℃-30℃）放置15 分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上充分浸润膜，不要让工作液滴在离心柱管壁上挂壁不能充分和膜接触。

 向离心柱中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000 rpm 离心30秒，弃废液，将离心柱放回收集管中。

 接操作步骤（三）样品纯化下面第4步，完成后续步骤。