DiD，DiO，DiI，DiR，DiS 细胞膜染料

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。

它们的荧光颜色区分明显：DiI(橙色荧光)，DiO(绿色荧光)，DiD(红色荧光)和 DiR (深红色荧光)这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分别用标准的 FITC和TRITC的滤光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激发，有着比DiI更长的激发波长和发射波长，在细胞和组织染色中更有价值。 DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

图1. DiO、DiI、DiD、DiR 光谱图

* Omega滤光器由Omega公司提供(www. omegafilters.com);Chroma滤光器由Chroma公司提供(www. chroma.com)。

**DiR的发射波长肉眼不可见，所以需要配备CCD镜头或其他的近红外检测仪器。

使用方法：

1. DiD，DiO，DiI，DiR 染色液制备

(1)配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。

注意：未使用的储存液保存在-20 oC，避免反复冻融。

(2)工作液制备：用合适的缓冲液(如：无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为1～5 µM的工作液。

注意：工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的十倍以上寻找最佳条件。

2. 悬浮细胞染色

(1)悬浮细胞密度为 1 × 106/mL加入到工作液中。

(2)在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。

(3)染色细胞试管在1000～1500转离心5分钟。

(4)倾倒上清液，再次缓慢加入预温37℃的培养液。

(5)重复(3)，(4)步骤两次以上。

3. 粘壁细胞的染色

(1)使粘壁的细胞在无菌实验室培养。

(2)从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。

(3)在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

(4)在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。

(5)吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养5～10分钟，然后吸干培养基。

4. 显微镜检测

(1)DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择参见表1。

(2)多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：

a) DiI和DiO=Omega XF52，Chroma 51004;

b) DiI和DiD=Omega XF92，Chroma 51007;

c) DiI，DiO和DiD=Omega XF93，Chroma 61005

5. 流式细胞仪的检测

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。