Cell Counting Kit(CCK 试剂盒)

产品简介：

Cell Counting Kit 简称CCK 试剂盒，为MTT 法的替代方法，是一种基于WST(水溶性四唑盐，化学

名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞

毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK 法与其它检测方法之间的比较：

CCK 用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

操作说明：

一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例(例如：1/2 比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，

每组3-6 个复孔。

3、接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加CCK 试剂培养一定时间后测定OD 值，制作出一条以细胞数

量为横坐标(X 轴)，OD 值为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数

量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK 后的培养时间。)

二、细胞活性检测

1、在96 孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37℃,5% CO2 的条件下)。

2、向每孔加入10 μL 的CCK 溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。

4、用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS

溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增值-毒性检测

1、在96 孔板中配置100μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 小时(在37℃，5% CO2 的条件下)。

2、向培养板加入10μL 不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24 或48 小时)。

4、想每孔加入10μL CCK 溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。

6、用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

7、如果暂时不测定OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS

溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK 之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养

基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培

养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

备注：

①建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK 试剂后的培养时间。

②有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔减的差异。加入CCK 试剂时，建议斜贴着培

养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD 值读数。

③白细胞可能需要培养较长时间。

④当使用标准96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵

敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24 孔板或6 孔板实验，

请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK 溶液。

⑤如果没有450nm 的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片，但是450nm 滤光片的检测灵

敏度最高。

⑥培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影

响。

活力计算：

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0 加药)-A(空白)] ×100

A(加药)：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0 加药)：具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

保存条件：

4℃避光保存，有效期一年。

Alamar Blue Kit(Alamar Blue 试剂盒)

产品简介：

    Alamar Blue 检测试剂为细胞增殖和细胞毒性检测提供了一种简便、快速、可靠、安全的方法，适用于

高通量检测实验。该检测试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂。其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，

而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，吸收峰为530-560nm，而散射峰为590nm。

在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN 和NADH/NAD 的比值升高，

处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，

使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。最后用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，吸光度

和荧光强度与活性细胞数成正比。

操作说明：

1. 在100 微升细胞悬液中加入10 微升的检测试剂，在细胞培养箱内孵育2-6 小时，培养基的颜色

由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

2. 推荐使用荧光酶标仪进行检测，激发光波长在530-560 nm 之间，发射光波长为590 nm，记录相

对荧光单位(RFU)。

3. 绘制标准曲线或细胞生长曲线：纵座标(Y 轴)为相对荧光单位(RFU);横坐标(X 轴)为细

胞数或时间点或药物浓度。

保存条件：

4℃避光保存，有效期一年。

注意事项：

1. 合适密度的细胞可以增加检测灵敏度。对于96 孔板，我们建议每孔接种100 微升细胞，细胞浓

度范围为：贴壁细胞在100-10,000/孔，悬浮细胞在2,000-50,000/孔，并以培养基为空白对照。对

于384 孔板，细胞浓度和接种量均减半。

2. 整个过程均应为无菌操作，因为微生物污染物同样可以还原检测试剂而影响实验结果。

3. 注意接种细胞浓度和加入检测试剂后孵育时间。细胞浓度过高或孵育时间过长，会导致继发性还

原反应，产生无色和荧光消失。

4. 孵育时，须避光。

5. 本产品可以使用荧光或分光光度检测，但荧光的灵敏度高，实验误差小，推荐使用荧光检测。