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免疫沉淀试剂盒KIP-1

时间:2017-12-04 15:22:29 浏览:

免疫沉淀试剂盒 KIP-1

利用抗原抗体亲和结合的特性,免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP) 是一种能够将靶蛋白进行纯化分离的实验技术。该试剂盒包含免疫沉淀以及后续 Western blotting 检测全部试剂,通过对富集的靶蛋白高效快速分离,以对免疫沉淀实验提供最佳解决方案,同时该试剂盒还具有省时、高效、抗体用量少等优点。关于试剂盒 IP lysis buffer 能够有效提取细胞或组织总蛋白,用于后续实验使用。 Protein A sepharose beads slurry 用于沉淀分离抗原抗体复合物。 高盐、低 pH 的 Elution buffer 有效用于抗原抗体复合物与 Protein A sepharose beads 的解离。 Spin columns 的使用使操作更为方便快捷,且减少靶蛋白的损失,同时降低了非特异性蛋白的影响。 HRP-conjugated Protein A 二抗用于 Western blotting 的检测,可有效消除抗体轻链信号的影响,同时降低抗体链重链信号。 该试剂盒可广泛用于免疫沉淀以及免疫共沉淀实验。

 

重要说明:

 该试剂盒仅用于细胞或组织裂解物的免疫沉淀和免疫共沉淀实验。

 除特别说明外,所有操作在冰上完成。

 碱中和液避免接触皮肤以及眼睛。

 

操作步骤

1. 细胞或组织裂解物的制备

细胞

 将离心机预冷至 4 °C。

 收集细胞前用血球计数板对细胞进行计数。

4 °C、1000 ×g (半径为 9.5 cm 的转头约为 3000 rpm) 离心 5 min,收集细胞。

用冰上预冷的 1 ×PBS 洗涤细胞三次,每 106个 细胞加入 100 μl 预冷的 IP lysis buffer(含有 1 ×Protease inhibitor)。

若需获得高浓度蛋白裂解物,可以适量减少 IP lysis buffer 的用量。

若靶蛋白为磷酸化蛋白质,则需额外加入适量磷酸酶蛋白抑制剂。

在 IP lysis buffer 中重悬细胞,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 轻柔颠倒一次。

后续步骤见裂解与保存。

 

组织

 解剖目的组织,用预冷的 1 ×PBS 洗涤组织,尽可能去除组织中存留的血液,在冰上将目的组织剪成碎块。

将组织碎块置于预冷的匀浆器中。

以每毫克目的组织 50 μl IP lysis buffer 的量加入相应数量的 IP lysis buffer (含有 1 ×Protease inhibitor)。

 对目的组织充分匀浆,冰上裂解 30 min,期间每 10 min 颠倒一次。

后续步骤见裂解与保存。

 

裂解与保存

超声波破碎细胞或组织裂解物,使得裂解更加充分,同时使 DNA 片段化。

不同样品最适超声时间不同,在 180 W 功率下(超声 10 s 停 10 s 的循环),一般细胞超声 1 min,组织超声 2-5 min,整个超声过程在冰上进行。

裂解物冰上放置 60 min,期间每 10 min 颠倒一次。

4 °C、10,000 ×g (半径为 9.5 cm 的转头约为 9700 rpm) 离心 20 min,将上清转入新的 EP 管中备用;弃沉淀或储存用于后续问题分析。

通过 Bradford 或 BCA 法测定裂解物的总蛋白浓度。

裂解物用于 IP 或 Western blotting 实验,也可以置于-80 °C 保存。

若用于 Western blotting 实验,SDS-PAGE 检测前,需向裂解物中加入 25 % 样品体积的 5 ×Sample buffer ,并沸水浴加热 5 min。

 

2. Protein A sepharose beads 的准备

旋转储存 Protein A sepharose beads slurry 的管子,取出所需数量的 Protein A sepharose beads slurry,以其 10 倍体积的 1 ×PBS 通过瞬时离心洗涤 Protein A sepharose beads slurry,并将 Protein A sepharose beads slurry 重悬至原体积。

 

3. 裂解物预处理(可选)

以 45°角剪掉已灭菌枪头的末端,快速吸取重悬的 Protein A sepharose beads slurry,加入含有裂解物的 EP 管中。

通常 1-3 mg 总蛋白裂解物需加入 30 μl 重悬的 Protein A sepharose beads slurry。

4 °C 旋转孵育 60 min。 4 °C、1000 rpm 离心 1 min,将上清转入新的 EP 管中。

 

4. 免疫沉淀

 吸取含有 1-3 mg 总蛋白的裂解物(或预处理)200-350 μl,加入下端带有 End caps 的 Spin columns 中,同时加入 1-4 μg 特异性抗体以及 150-300 μl Incubation buffer,最佳抗体数量应由抗体效价决定。

向相同数量的裂解物与 Incubation buffer 中加入同种属相同数量的 Control IgG 作为阴性对照。

4 °C 下,旋转孵育过夜或 2-4 h。

向 Spin columns 中加入 50 μl 重悬的 Protein A sepharose beads slurry 以沉淀免疫复合物,4 °C 旋转孵育 1-4 h。

取下 End caps,将上清流出弃除,必要时,可以通过重悬 Protein A sepharose beads slurry 以提高上清的流速。

用 800 μl 1 ×Washing buffer(纯水稀释 20 ×Washing buffer;含有 1 ×Protease inhibitor)洗涤沉淀复合物 4-5 次。

洗涤结束后,在 4 °C,500 rpm 下将 Spin columns 置入 Collection tubes 中离心 30 s,弃 Collection tubes 以及离心产物。

 

5. 洗脱

将 Spin columns 置入新的 1.5 ml EP 管中以收集洗脱产物,用 40 μl Elution buffer 洗脱沉淀复合物,并在 4 °C、10000 rpm 下离心 1 min 收集产物,重复洗脱一次。

向洗脱产物中加入 10 μl Alkali neutralization buffer 以及 30 μl 5 ×Sample Buffer ,沸水浴加热 5 min。

 

6. Western blotting 分析

取 20-40 μl IP 样品加入 SDS-PAGE 对应泳道, 同样可以将剩余 IP 样品置 于-80 °C 保存备用。

通过 SDS-PAGE 分离 IP 样品,并将蛋白质向 PVDF 膜 转移。

使用检测抗体杂交以及 1:1500-1:3000 稀释度的 HRP-conjugated protein A 二抗进行 Western blotting 分析。

 

补充信息

如果需要缩短 IP 实验操作时间,也可以将靶蛋白对应的特异性抗体以及 Protein A sepharose beads slurry 同时加入细胞或组织裂解物中进行一步孵育。

若 IP 抗体与 WB 一抗同为 mouse IgG1 或 IgG3 亚型, WB 检测时可降低 HRP-conjugated protein A 二抗的稀释度,若显影目的信号仍然较弱,可考虑使用 Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗。

若 WB 检测时一抗为 mouse IgM 亚型,则不能使用 HRP-conjugated protein A 二抗。

必要时,该试剂盒可以按比例扩大使用。


 

 

商品货号:

规格:

基本售价:

KIP-1

20

1500

KIP-2

20               

1500



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