【产品简介】

本产品是专为两步法 RT-PCR 第一步实验设计的超高灵敏度 RT-PCR 反应系统，可以从极低量的总 RNA 或 poly(A) mRNA 合成第一链 cDNA，并能够通读 GC 含量高、二级结构复杂的 RNA 模板。该试剂盒使用聚合美特制的M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RTase)，该RTase通过多点定点突变去除了 RNase H 的活性 (RNase H－)，并增加了RTase酶与模板－引物之间的亲和力，具有更好的热稳定性，因此其聚合酶的活性和持续合成能力均高于野生型的 M-MuLV RTase，合成的 cDNA 产量更高，长度可达 15 kb。另外，本产品将引物配比、反转录酶和RNase抑制剂优化成mix形式，精简了试剂盒组成，非常简便操作，而且对后续Realtime PCR反应体系影响也降到最低。

【产品特点】

1) 方便快捷：mix配制，组分更少，操作更快；逆转录只需15min就可以完成。

2）超强对后续qPCR反应适用性：通过组分和Buffer优化，使带入到后续qPCR反应的逆转录反应液的影响降到最低。

3）高灵敏度：对极少量的RNA模板也可以进行良好的反转录反应。

【储存条件】

长期保存，请置于-20˚C，有效期12个月。使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。

【产品组分】

                                               MF012-50T       MF012-200T

5x M5 RT Super Mix*                     80 μl             400 μl

5x M5 RT Super Mix Control**       8 μl              40 μl

DEPC-ddH₂O                                 0.5 ml           2x1 ml

* 5x M5 RT Super Mix：由M5 M-MuLV Reverse Transcriptase，RNase inhibitors, Oligo dT primer, Random Primer, Buffer, dNTPs等构成的Mix形式。打开盖子前，请先离心，使液体落在离心管底部后再使用。另外，本试剂粘度很高，请小心使用移液器。

**5x M5 RT Super Mix Control：该组分是5x M5 RT Super Mix去除了M5 M-MuLV Reverse Transcriptase的mix，可以用于反转录的对照。打开盖子前，请先离心，使液体落在离心管底部后再使用。另外，本试剂粘度很高，请小心使用移液器。

【活性定义】

以 poly(rA)为模板，oligo(dT)为引物，在 42˚C条件下，10 分钟内催化 1 nmol 的 dTTP 所需要的酶量定义为一个活性单位(U)。

【注意事项】

 实验过程中请全程注意避免 RNase 污染。

 除酶以外的各种试剂，使用之前请完全溶解并充分混匀，以防因盐离子浓度不均影响实验结果。

 RNA 模板的完整性对 cDNA 合成效率起着决定性作用，因此请选择可靠的 RNA 提取/纯化方法。建议使用M5 Total RNA Extraction Reagent (TRIgent)(货号 MF034-01) 制备高质量的 RNA 模板，并设置反转录反应阳性对照。

 由于所有的 RNA 提取方法都不能完全去除基因组 DNA，所以应根据后续实验的需求，选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组 DNA。RNase-free DNase I 处理的具体方法见本说明书附录。

 M5 M-MuLV RTase以 RNA 为模板获得全长的第一链 cDNA，其起始位点由所用引物所决定：

1) 随机引物 (Random Primer) 在 RNA 模板上没有特异性结合位点，所有 RNA 都可以做为第一链 cDNA 合成的模板；

2) Oligo dT Primer 只能以 poly(A) mRNA 作为 cDNA 合成的模板；

3) 采用序列特异性引物 (Gene Specific Primer) 以其结合位点为起始位点。

 M5 M-MuLV RTase合成的第一链 cDNA 产物可直接加入 PCR 反应混合物中进行扩增。PCR 扩增使用的耐热 DNA 聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC 含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。

 第一链 cDNA 合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板，合成含各种标记的 cDNA，作为杂交实验的探针。

 RNA 可置于-70˚C以下长期保存，cDNA 合成产物可置于-20˚C保存。

【操作流程】

 1. RNA通常具有复杂的二级结构，为了获得更高的合成效率，将RNA 模板65˚C孵育 5 分钟，以打开RNA 的二级结构。

 2．然后立即放入冰浴 2min。

   在冰上加入下列成分（可根据需要，扩大反应体系）：

     5x M5 RT Super Mix                2 μl

     RNA 模板                    0.01~1µg

     DEPC-ddH₂O              补足至 10 μl

   进行反转录阴性对照时，可用5x M5 RT Super Mix Control代替5x M5 RT Super Mix，可以确认信号是否来自cDNA。轻轻混匀，短暂离心；37˚C孵育，15min；50˚C孵育，5min（可选）。

   96˚C加热 5 分钟使酶失活；置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

【补充说明】

以下流程为选做步骤，请根据实验情况酌情选择。

1．RNase-free DNase I 处理 RNA 模板的方法：

1) 在 DNase，RNase-free 离心管中加入下列试剂：

     RNA 样品                          2-5μg

     10× DNase I Buffer            1μl

     DNase I (2 U/μl)               0.5 μl

     RNase Inhibitor                0.25 μl

     DEPC-ddH₂O 补足至         10μl

2) 混匀，短暂离心，37˚C放置 30 分钟；

3) 加入 1 μl 50 mM EDTA，65˚C放置 15 分钟使 DNase I 失活;或者直接使用酚/氯仿抽提去除 DNase I；

4) 为避免干扰反转录体系，RNA 加入量最好不超过反转录体系的 1/5，如果 RNA 浓度过低，建议沉淀浓缩后使用。

2．去除第一链 cDNA 合成产物中的 RNA 方法：

1) 加入 0.5μl RNase H，混匀，30˚C反应 20 分钟，70˚C放置 20 分钟；

2) 取 5 μl RNase H 处理的 cDNA，加入 95 μl ddH₂O (即稀释 20 倍)；

3) 取 2 μl 稀释后的 cDNA 作为模板用于 PCR 扩增。